Mekanisme yang digunakan GPI untuk menukar glukosa 6-fosfat dan fruktosa 6-fosfat (aldosa kepada ketosa) terdiri daripada tiga langkah utama: membuka gelang glukosa, mengisomerikan glukosa kepada fruktosa melalui perantaraan enediol, dan menutup gelang fruktosa.[3]

Pengisomeran glukosa

Glukosa 6-fosfat mengikat GPI dalam bentuk piranosa. Cincin dibuka dalam mekanisme "tolak-tarik" oleh His388, yang memprotonasi oksigen C5, dan Lys518, yang menyahproton kumpulan hidroksil C1. Ini mewujudkan aldosa rantai terbuka. Kemudian, substrat diputarkan di ikatan C3-C4 bagi pengisomeran. Pada ketika ini, Glu357 menyahproton C2 untuk mencipta perantaraan cis-enediolat yang distabilkan oleh Arg272. Untuk melengkapkan pengisomeran, Glu357 mendermakan protonnya kepada C1, kumpulan hidroksil C2 kehilangan protonnya, dan fruktosa 6-fosfat ketosa rantai terbuka terbentuk. Akhirnya, cincin ditutup dengan memutarkan substrat mengenai ikatan C3-C4 sekali lagi dan menyahprotonasi hidroksil C5 dengan Lys518.[4]